第四章:酶与细胞的固定化

发布于:2021-09-24 04:03:14

第四章:酶与细胞的固定 化

4.1 引言
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酶作为催化剂的缺点:
其高级结构对环境十分敏感,易受物理( 其高级结构对环境十分敏感,易受物理(温度、压力、 电磁场)化学条件( 电磁场)化学条件(氧化、还原、有机溶剂、金属离 子、离子强度、PH)影响而失活。 子、离子强度、PH)影响而失活。




反应后不能回收,只能采用分批法进行生产. 反应后不能回收,只能采用分批法进行生产.
酶反应后成为杂质与产物混合在一起增加了下游 酶反应后成为杂质与产物混合在一起增加了下游 加工成本。

? 如果能设计一种方法,将酶束缚于特殊的相,使它

与整体相(或整体流体) 与整体相(或整体流体)分隔开,但仍能进行底物和 效应物(激活剂或抑制剂) 效应物(激活剂或抑制剂)的分子交换。这种固定化 的酶可以像一般化学反应的固体催化剂一样,既具 有酶的催化特性,又具有一般化学催化剂能回收、 反复使用等优点,并且生产工艺可以连续化、自动 化。20世纪50年代发展起来的固定化技术正是基于 化。20世纪50年代发展起来的固定化技术正是基于 这一目的发展起来的。随着固定化技术的发展,作 为固定化的对象不仅有酶,也可以有微生物细胞或 细胞器,这些固定化物可统称为固定化生物催化剂。 固定化生物催化剂在节能,降低成本,保护环境, 生产自动化、连续化等许多方面都是十分有利 的.它为酶的应用开拓了广阔的前景。

? 然而,真正投入工业化应用的固定化酶却不

多,原因是固定化使用的试剂和载体成本高、 固定化效率低、稳定性差、连续操作使用的 设备比较复杂。进一步开发更简便、更适用 的固定化方法以及性能更加优异的载体材料, 使更多的固定化酶和细胞取得工业规模应用, 仍然是这个领域追求的目标。

4.2 酶的固定化
? 一、定义:

所谓固定化酶(immobilized enzyme), 所谓固定化酶(immobilized enzyme), 是指在一定空间 是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶.能连续地 空间内呈闭锁状态 闭锁状态存在的酶.能连续地 进行反应,反应后的酶可以回收重复使用。因此, 进行反应,反应后的酶可以回收重复使用。因此, 不管用何种方法制备的固定化酶,都应该满足上述 固定化酶的条件。例如,将一种不能透过高分子化 合物的半透膜置人容器内,并加入酶及高分子底物, 使之进行酶反应,低分子生成物就会连续不断地透 过滤膜.而酶因其不能透过滤膜而被回收再用.这 种酶实质也是一种固定化酶。

固定化酶的优点
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧

极易将固定化酶与底物、产物分离; 极易将固定化酶与底物、产物分离; 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反 应 在大多数情况下,能够提高酶的稳定性; 在大多数情况下,能够提高酶的稳定性; 酶反应过程能够加以严格控制; 酶反应过程能够加以严格控制; 产物溶液中没有酶的残留,简化了提纯工艺 产物溶液中没有酶的残留,简化了提纯工艺 较游离酶更适合于多酶反应 游离酶更适合于多酶反应 可以增加产物的收率,提高产物的质量: 可以增加产物的收率,提高产物的质量: 酶的使用效率提高,成本降低。 酶的使用效率提高,成本降低。

固定化酶的缺点
? 固定化时,酶活力有损失; 固定化时,酶活力有损失; ? 增加了生产的成本,工厂初始投资大: 增加了生产的成本,工厂初始投资大: ? 只能用于可溶性底物,而且较适用于小分子

底物,对大分子底物不适宜; 底物,对大分子底物不适宜; ? 与完整菌体相比不适宜于多酶反应,特别是 与完整菌体 菌体相比不适宜于多酶反应,特别是 需要辅助因子的反应; ? 胞内酶必须经过酶的分离手续。 胞内酶必须经过酶的分离手续。

? 对酶固定化后酶活可产生不同影响,和可溶

性酶比较会出现酶活力的降低或升高两种情 况。例如,交联的枯草杆菌蛋白酶晶体水解 氨基酸酯的活力比可溶性酶低96. 氨基酸酯的活力比可溶性酶低96.4%。然而, 使用固定化的脂肪酶或酶制备物在溶剂中合 成酯,其活力比酶粉增加40倍。 成酯,其活力比酶粉增加40倍。

二、固定化酶的制备原则
? 固定化酶要根据不同的酶、使用目的和使用环境来

选择不同的方法。但要遵守以下原则 ? 必须注意维持酶的催化活性及专一性。 ? 固定化应该有利于生产自动化、连续化。 ? 固定化酶应有最小的空间位阻,尽可能不妨碍酶与 底物的接*,以提高产品的产量。 ? 酶与载体必须结合牢固,从而使固定化酶能回收贮 藏.利于反复使用。 ? 固定化酶应有最大的稳定性,所选载体不与废物、 产物或反应液发生化学反应。 ? 固定化酶成本要低,以利于工业使用

三、固定化酶的方法 三、固定化酶的方法
共价结合 载体结合法 离子结合 物理吸附法 网格型 包埋法 微囊型 交联法

1、载体结合法
? 将酶结合于水不溶性载体的一种固定化方法。

又可分为物理吸附法、离子结合法和共价结 合法。 酶 载体

1) 物理吸附法
酶被物理吸附于不溶性裁体的一种固定化方法。 ? 此类载体很多,无机载体有多孔玻璃、活性炭、酸 性白土、漂白土、高岭石、氧化铝、硅胶、膨润土、 羟基磷灰石、磷酸钙、金属氧化物等;天然高分子 载体有淀粉、白蛋白等;大孔型合成树脂、陶瓷等, 此外还有具有疏水基的载体(丁基或己基— 此外还有具有疏水基的载体(丁基或己基— 葡聚糖 凝胶) 凝胶)可以疏水性吸附酶,以及以单宁作为配基的纤 维素衍生物等裁体。
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特点
? 酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少

的优点,因而酶活力损失少。操作简便、条 件温和。 ? 缺点是酶与载体相互作用力弱、酶易脱落

2)离子结合法
? 酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不

溶性载体的固定化方法。 ? 常用载体有阴离子交换剂如DEAE-纤维素, 常用载体有阴离子交换剂如DEAEDEAE·葡聚糖凝胶,Amberlite IRA-93,IRADEAE·葡聚糖凝胶,Amberlite IRA-93,IRA410,IRA-900:阳离子交换剂如CM410,IRA-900:阳离子交换剂如CM-纤维素, Amberlite CG-50,IRC—50,IR—120,DowexCG-50,IRC—50,IR—120,Dowex50等。 50等。

特点
离子结合法的操作简单.处理条件温和,酶 的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被 破坏,能得到酶活回收率较高的固定化酶。 ? 但是载体和酶的结合力比较弱,容易受缓冲 液种类或PH的影响,在离子强度高的条件下 液种类或PH的影响,在离子强度高的条件下 进行反应时,酶往往会从裁体上脱落。
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迄今已有许多酶用离子结合法固定化,例如 1969年最早应用于工业生产的固定化氨基酰 1969年最早应用于工业生产的固定化氨基酰 化酶就是使用多糖类阴离子交换剂DEAE化酶就是使用多糖类阴离子交换剂DEAE-葡 聚糖凝胶固定化的。

3) 共价结合
? 酶以共价键结合于载体的方法。

载体



功能团

载 体



? 两类:一是载体自身具有功能团,经活化后与 两类:

酶结合。另一类则是用双功能团活化载体, 再与酶结合。

a 重氮法
R ? NH2 ?NaNO2, HCl →[R ? N + ≡ N]Cl - ?[E] R ? N = N ? [E] ? ?? ?→

R-NH2含芳香族氨基的水不溶性载体,酶蛋白中的游离 氨基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸中的酚基等参与此反 应。

R0H纤维素或 其它多糖类载 体,后者β-硫 酸酯乙砜基苯 胺(SESA)
优点:载体廉价, 且在酶分子与载 体之间间隔了 ABSE基团,酶分 子有较大的空间 自由度,减少载 体的空间*

? 酶蛋白中酪氨酸含量较高的木瓜蛋白酶、脲酶、

葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶、β-葡萄糖苷酶等 葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶、β 与重氮化载体连接,获得活性较高的固定化酶。

B、迭氮法
? ROCH2COOH+CH3OH

ROCH2COOCH3+H2O ? ROCH2COOCH3+NH2NH2 ROCH2CONHNH2+C H3OH ? ROCH2CONHNH2+HNO2 ROCH2CON3+2H2O ? ROCH2CON3+HO-[E] ROCH2CO-O[E] +HOCO? ROCH2CON3+HS-[E] ROCH2CO-S[E] +HSCO-

C 溴化氰法
? 含有羟基的载体,如纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖

凝胶等。

Axen等开发的方法,它不局限于酶,可以广泛应用于机体成 Axen等开发的方法,它不局限于酶,可以广泛应用于机体成 分的固定化。异脲型是主要生成物。此法能在非常温和条件 下与酶蛋白的氨基发生反应,它已成为*年来普遍采用的固 定化方法,尤其是溴化氢活化的琼脂糖已在实验室广泛用于 制备固定化酶以及亲和析的固定化吸附剂。

D、烷基化法

可与酶分子上的氨基、巯基、羟基等发生烷基化反应。

共价结合法的特点
优点:酶结合牢固,不会脱落,可连续使用 较长时间 缺点:活化操作复杂、共价结合可能影响酶的 空间构象从而影响酶的活性。
解决方法:1、采用已活化的载体。现已有商品出售 商品名:偶联凝胶(Coupling Gel) 2、了解偶联凝胶特性和酶的特性,避免酶活性中心 基团被偶联。

产品介绍
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CNBr Activated Sepharose 4B溴化氰活化琼 4B溴化氰活化琼 脂糖凝胶4B偶联基团颗粒大小: 45脂糖凝胶4B偶联基团-NH2 颗粒大小: 45165?m偶联条件: pH8165?m偶联条件: pH8-10 4℃保存Pharmacia 4℃保存Pharmacia 17-0430-01 5g 960 15g 2717 17-0430FF用高纯度的琼脂糖凝胶和环氧物 环氧琼脂糖 FF用高纯度的琼脂糖凝胶和环氧物 质反应而成,优点:有长短更适合的亲水结合臂, 无杂吸附,亲和色谱有更好的分离效果。偶联的 配基更加稳定,不易脱落,使用寿命长。活化时, 对琼脂糖凝胶还有交联的作用,从而使琼脂糖凝 胶刚性更好,流速更快。可偶联含有-OH, 胶刚性更好,流速更快。可偶联含有-OH,-SH 或-NH2的配基,使用范围广 NH2的配基,使用范围广

2 交联法
? 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用, 借助双功能试剂 双功能试剂使酶分子之间发生交联作用,

制成网状结构的固定化酶的方法。常用双功 能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、 双偶氮苯等。最常用的是戊二醛。 双偶氮苯等。最常用的是戊二醛。
酶 酶
双功 能试 剂









特点
? 优点:结合牢固,可长时间使用。 ? 缺点反应条件剧烈,酶活损失大;制备的固定化颗

粒较小,使用不便。 交联法反应条件比较激烈,固定化的酶活回收率一 般较低,但是尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时 间将有利于固定化酶比活力的提高。 可采用双重固定化法,先将酶用凝胶包里或用硅胶 吸附再交联,可制备出酶活性高、机械强度好的固 定化酶。

3、包埋法
? 将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中,使 将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体 多孔载体中,使

酶固定化的方法。 常用的载体有:琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、 角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、 聚酰胺、火棉胶等。 ? 分为凝胶包埋法(网格型)和半透膜包埋法 分为凝胶包埋法(网格型) 微囊型) (微囊型)

特点
? 一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应,

很少改变酶的局部结构,酶活回收率较高,因此可 以应用于许多酶、微生物和细胞器的固定化。 ? 在包埋时发生化学聚合反应,酶容易失活,必须巧 妙设计反应条件。 ? 由于只有小分子可以通过高分子凝胶的网格扩散, 并且这种扩散阻力还会导致固定化酶动力学行为的 改变,降低酶活力。因此,包理法只适合作用于小 分子底物和产物的酶,对于那些作用于大分子底物 和产物的酶是不适合的。

1)凝胶包埋法
? 将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中,制

成一定形状的固定化酶。大多数为球状或片状。 成一定形状的固定化酶。大多数为球状或片状。 ? 载体材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合 成高分子化合物以及淀粉、明胶、胶原、海藻酸和 角叉莱胶等天然高分子化合物。合成高分子化合物 常采用单体或预聚物在酶或微生物存在下聚合的方 法,而溶胶状天然高分子化合物则在酶或微生物存 在下凝胶化。网格型包埋法是固定化微生物中用得 最多、最有效的方法。

2)半透膜包埋法(微囊型)
? 将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球

内,制成固定化酶。 ? 微囊型固定化酶通常直径为几微米到几百微 米的球状体,颗粒比网格型要小得多,比较 有利于底物和产物扩散,但是反应条件要求 高,制备成本也高。 ? 常用方法是界面沉淀法、界面聚合法、二级 乳化法、脂质体包埋法等。

A )界面沉淀法 )界面沉淀法
? 利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极

低而形成皮膜将酶包埋。例如,先将含高浓度血红 低而形成皮膜将酶包埋。例如,先将含高浓度血红 蛋白的酶溶液在水不互溶的有机相中乳化.在油溶 性的表面活性剂存在下形成油包水的微滴,再将溶 于有机溶剂的高聚物加入乳化液中,然后加入一种 不溶解高聚物的有机溶剂,使高聚物在油— 不溶解高聚物的有机溶剂,使高聚物在油—水界面 上沉淀、析出、形成膜,将酶包埋,最后在乳化剂 的帮助下由有机相移入水相。此法条件温和,酶失 活少.但要完全除去膜上残留的有机溶剂很麻烦。 作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚 甲基丙烯酸甲酯等。

B)界面聚合法
?

利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合的 原理包埋酶。例如,将含10%血红蛋白的酶溶液与 原理包埋酶。例如,将含10%血红蛋白的酶溶液与 1.6—己二胺的水溶液混合,立即在含1%斯盘— 己二胺的水溶液混合,立即在含1%斯盘— 85(“pan·85)的氯仿— 85(“pan·85)的氯仿—环乙烷中分散乳化,加入溶于 有机相的癸二酰氯后,便在油— 有机相的癸二酰氯后,便在油—水界面上发生聚合 反应,形成尼龙膜,将酶包埋。除尼龙膜外还有聚 酰胺、聚脲等形成的微囊。此法制备的微囊大小能 随乳化剂浓度和乳化时的搅拌速度而自由控制,制 备过程所需时间非常短。但在包埋过程中由于发生 化学反应会引起酶失活。

C) 二级乳化法
?

酶溶液先在高聚物( 酶溶液先在高聚物(常用乙基纤维素、聚苯 乙烯等) 乙烯等)有机相中乳化分散,乳化液再在水相 中分散形成次级乳化液,当有机高聚物溶液 固化后,每个固体球内包含着多滴酶液。此 法制备比较容易,但膜比较厚,会影响底物 扩散。

D)脂质体包埋法 D)脂质体包埋法
? 由表面活性剂和卵磷脂等形成液膜包埋酶,

其特征是底物或产物的膜透过性不依赖于膜 孔径大小,而只依赖于对膜成分的溶解度, 因此可加快底物透过膜的速度。

理想的固定化方法
? 要有温和的化学条件,固定化酶的量大.在

小体积内为酶底物接触提供大量的表面积, 具有化学、机械稳定性。

? Parthasarathy

R.V.和 R.V.和Charks R.Martin 等建立的聚 合微胶囊排布的方法。用微孔聚碳酸酯滤膜制备微 囊,膜有圆柱形孔,作为制备微囊的模板。他们用 模板法获得直径、长度均一的中空聚合微囊,微囊 高密度地排布,每个微囊从表面伸出,像牙刷毛一 样。微囊里可演充高密度的酶,负载了酶的微囊排 布可起生物反应器的作用,既可在水溶液中、也可 在有机溶液中起作用。这种微囊的壁很薄,仅有 25nm,电子可以通过,但有非常好的机械强度.迄 25nm,电子可以通过,但有非常好的机械强度.迄 今已固定了过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶。微囊不渗 漏,而且可在无水有机溶剂中作用。是较理想的固 定化方法。

4 热处理法
? 将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间,

使酶固定在菌体内,而制备得到固定化在菌 体内的酶。适用于热稳定性较好的酶。载体 体内的酶。适用于热稳定性较好的酶。载体 为菌体。 为菌体。

方法比较

可能变化


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